主要研究テーマ

1.DNAワクチンに関する研究
 

細胞内寄生菌に対する指向性DNAワクチンの開発

結核に対するDNAワクチンの研究
CpGモチーフによって発現誘導される遺伝子の解析
CpGモチーフの細胞傷害性T細胞に対するアジュバント効果
DNAワクチンによるI型過敏症の予防/治療

2.遺伝子治療の基礎的研究

レトロウイルスおよびアデノウイルスベクターを用いた研究

3.慢性関節リウマチの発症機序に関する研究

4.慢性炎症性腸炎の発症機序に関する研究


1.DNAワクチンに関する研究

Uchijima M., Yoshida, A., Nagata T., Koide Y.: Optimization of codon usage of plasmid DNA vaccine is required for the effective MHC class I-restricted T cell responses against an intracellular pathogen. J. Immunol. , 161:5594-5599.

Abstract
In an attempt to study codon usage effects of DNA vaccines on the induction of MHC class I-restricted  T cell responses against an intracellular bacterium, Listeria monocytogenes, we designed two plasmid DNA vaccines encoding an H-2Kd-restricted epitope of listeriolysin O (LLO) of L. monocytogenes, LLO 91-99. One DNA vaccine, p91wt, carries the wild type DNA sequence encoding LLO 91-99 and the other one, p91mam, possesses the altered DNA sequence in which the codon usage was optimized for murine system. Our read-through analyses with LLO 91-99/luciferase fusion genes confirmed that the optimized 91mam DNA sequence showed extremely higher translation efficiency than the wild type sequence in murine cells. Consistent with this, intramuscular injections of p91mam but not of p91wt into BALB/c mice were capable of inducing specific CTL and IFN-g-producing CD8+ T cells able to confer partial protection against listerial challenge. Taken together, these observations suggest that optimization of codon should be taken into consideration in the construction of DNA vaccines against nonviral pathogens.
 

細菌感染症に対するDNAワクチンの展望．Annual Review 免疫 1999　p.226-235.
［抜粋］
ワクチンの開発の歴史はジェンナーの種痘に始まり、約200年の歴史を持つ。その間に多くの感染症に対するワクチンが開発されてきた。なかでも種痘の効果は絶大であり、WHOは1980年5月に痘瘡根絶宣言を行った。WHOは痘瘡についでポリオ根絶計画を進めており、南北アメリカからポリオ患者の発生は見られなくなっている。このように、予防接種は感染症対策において最も確実で、しかも1993年の世界銀行の報告にもあるように経済効率の高い手段である。
　現在用いられているワクチンは概ね次のように大別される：1）弱毒生ワクチン（BCG、ポリオなど）、2）不活化ワクチン（日本脳炎、ワイル病など）、3）成分ワクチン（コンポーネントワクチン）（インフルエンザHA、改良百日咳など）、4）遺伝子組換えワクチン（B型肝炎ウイルスなど）、5）トキソイド（破傷風、ジフテリアなど）。このうち、不活化ワクチンおよび外毒素を無毒化したトキソイドはこれらに対する抗体を誘導する比較的安全なワクチンである。また、抗原性を示す成分を主体として開発された成分ワクチンおよび遺伝子組換えワクチンは不活化ワクチンに比し、不純物を含まないので、さらに安全なワクチンといえる。しかしながら、これらのワクチンは抗体産生は誘導できるが、細胞性免疫は誘導されにくい。ウイルス、結核菌、サルモネラ、クラミジア、リケッチア、原虫などの細胞内寄生体に対する感染防御には細胞性免疫が必要となるが、これらを誘導するためには現在のところ、弱毒生ワクチンに頼らざるを得ない。弱毒生ワクチンで成立した適応免疫は長期にわたり維持されることが多いが、一方で、強い局所反応や発熱を引き起こしたり、免疫不全の個体では重篤な全身感染症を起こす危険性、および毒力復帰の可能性も排除できない。
　この点において、近年開発されたDNAワクチンは抗体のみならず、細胞性免疫を強力に誘導できることで注目を浴びている。1993年にUlmerらはA型インフルエンザウイルスのNP遺伝子を発現プラスミドに組み込み、これをマウスに接種し発現させた。これにより、このウイルスに対する抗体のみならず、細胞傷害性T細胞（CTL）を誘導できること、さらにこのウイルスに対する感染抵抗性を賦与できることを報告した。これにより、DNAワクチンは一躍脚光を浴びることとなった。その後、このインフルエンザウイルスをはじめとして、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、HIVなどのウイルスに対するDNAワクチンの有効性が相次いで報告されたが、細菌感染に対するものは少ない。我々は細菌、特に細胞内寄生菌に対するDNAワクチンに関し研究している。
A. DNAワクチンとその接種法
　DNAワクチンとしては大腸菌由来のプラスミドが用いられる。このプラスミドは哺乳類の細胞内で目的の遺伝子を発現させるため、その上流に真核生物における強力なプロモーター、例えばサイトメガロウイルスのIE(immediate-early)プロモター/エンハンサーを配してあり、さらに下流にはpoly(A)末端配列を配してある。また、宿主筋肉内でさらに効率よく遺伝子を発現するようにプロモーターを改良する努力もされている。
　DNAワクチンの接種法は、一般的に1）骨格筋への注射（筋注）、2）皮内注射、3）遺伝子銃による経皮接種、4）経鼻接種、が行われている。このうち、最も普遍的に行われているのが筋注法であろう。筋細胞によるプラスミドの取り込みの機序は明らかではないが、T-tubulesの関与が示唆されている。マウスでは大腿四頭筋、前脛骨筋への接種がよく行われている。また、筋注の場合は免疫効率を高めるために、筋肉へのさまざまな前処置が行われている。すなわち、1）bupivacaine（局所麻酔薬）、2）カルジオトキシンなどがプラスミド筋注前に当該筋肉に投与される。また、高張液（25%sucrose）にプラスミドを溶解して筋注することも効果的である。これらはいずれも筋肉を変性させ、その結果、筋細胞が再生する過程で、プラスミドをよりよく取り込むと考えられている。筋注法で注意しなければならないことは、接種を注意深く行わないとよい結果が得られない点である。例えば、プラスミドを筋繊維に平行に注射した方が、直角に注射した場合よりも200倍取り込みがよいことが報告されている。その他、筋注に際しては様々な注意すべき点が多いので、実施に際してはThe DNA Vaccine Web (http://www.genweb.com/Dnavax/dnavax.html)を参照されたい。
　これに対し、遺伝子銃法ではプラスミドを金粒子にコートし、ヘリュームガスを用い、空気銃の要領で皮膚に撃ち込む。遺伝子銃法は1）筋注法に比し、100〜1000分の1のDNA量で同等の免疫効果をあげることができる、2）筋注法に比し、再現性に優れている、などの長所があり、我々は最近、専ら遺伝子銃法を行っている。
B.リステリア菌(Listeria monocytogenes)に対するDNAワクチン、特にコドンの影響について
　リステリア菌感染には、前記したようにCTLとTh1細胞の両者が防御免疫として働くので、細胞内寄生菌感染に対するDNAワクチンのモデルとして好都合である。リステリア菌感染細胞に対するCTLを誘導するMHCクラスIリガンド（CTLエピトープ）としては、LLO(91-99), p60(217-225), p60(449-457), mpl(84-92)の4種が知られており、これらはH-2Kdに拘束性を示す。このうち、主要なものは前2者である。また、Th1反応を誘導するMHCクラスIIリガンドとしてはI-Ek拘束性のLLO(215-226)が知られている。我々はこれらを発現プラスミドのCMVプロモーター/エンハンサーの下流に挿入して、リステリアに対するDNAワクチンを作成した。まず、野生型のLLO(91-99)DNA配列を挿入したDNAワクチン(p91wt)の有効性を検討したが、マウスに特異的CTLを誘導することはできなかった。そこで、リステリア菌とマウスのコドン使用頻度の検討を行った。その結果、リステリア(L. monocytogenes)のコドン使用の偏りはマウス（＝ヒト）の偏りと全く異なることが判明した。そこで、LLO(91-99)のコドンをマウスで最も出現頻度の高いものに改変した。これにより、マウス細胞での翻訳効率の改善が期待される。p91wtとp91mamの翻訳効率を検討するため、我々はそれぞれの下流にルシフェラーゼ遺伝子を挿入し(p91wt-Luc, p91mam-Luc)、これをBALB/3T3細胞株に導入した。この結果、発現するルシフェラーゼ活性により91wtと91mamの転写効率を検討した(read-through解析）。p91wt-Lucとp91mam-Lucではルシフェラーゼ遺伝子の上流にある91wtと91mamのDNA配列のみが異なるので、ルシフェラーゼ活性の差は91wtと91mamの転写効率の差による。表4に見られるごとく、予想以上にp91mamの転写効率が高いことが判明した。これに伴い、p91manのBALB/cへの接種は強い特異的CTL活性を誘導した。また、感作脾細胞をLLO(91-99)ペプチドで試験管内再刺激したところ、IFN-gの産生が認められた。 しかし、IL-4の産生は認めなかったので、p91mamはTc1細胞を誘導するものと考えられた。さらに、感染抵抗性を検討するため、L. monocytogenesを静脈内接種し、脾臓と肝臓のCFUを計測したところ、生菌免疫には及ばないが、充分な感染抵抗性を示した。一方、p91wtはこれらの免疫応答を誘導できなかった。

Koide Y., Nagata T., Yoshida A., Uchijima M.: DNA vaccines for infections with intracellular bacteria. Current Trends in Immunology, 1: 123-132, 1998.

[Abstract]
DNA vaccines could have potential  advantages over other types of vaccines that the vaccines can induce strong cellular immune responses, cytotoxic T lymphocytes (CTL) and Th1 cells, without resorting to live organisms or complicated protein formulation. The cellular immune responses are especially required for the protection against the infections with intracellular bacteria, suggesting that the pathogens seem to be suitable targets of DNA vaccines among bacteria. However, their application to bacterial infections have been less well documented. We constructed a DNA vaccine in which the bacterial codon usage was optimized for murine system. The codon-optimized DNA vaccine could induce CTL and protective immunity against Listeria monocytogenes. So far, DNA vaccine has been mainly applied to tuberculosis. We showed in this paper that codon bias in Mycobacterium tuberculosis,  unlike any other bacteria,  is comparable to those in Mus musculus and Homo sapiens, suggesting that codon-optimization is not required for the DNA vaccine against tuberculosis. In the construction of DNA vaccines against bacteria, attempts should be made to increase translational efficiencies of bacterial genes in the DNA vaccines by optimization of codon usage and by changing the translation initiation sequence to the optimal sequence defined by Kozak.

発表業績リスト（過去5年間）

 

1. Suzuki M, Aoshi T, Nagata T, Koide Y: Identification of H2-Dd- and H2-Ab-restricted T-cell epitopes on a novel protective antigen, MPT51, of Mycobacterium tuberculosis. Infect Immun (in press).

2.Miki K, Nagata T, Tanaka T, Kim Y-H, Uchijima M, Ohara N, Nakamura S, Okada M, Koide Y: Induction of protective immunity against Mycobacterium tuberculosis by recombinant attenuated self-destructing Listeria monocytogenes strains harboring eukaryotic expression plasmids for Ag85 complex and MPB/MPT51. Infect Immun 72(4):2014-2021, 2004.

3.Kageyama Y, Koide Y, Uchijima M, Nagata T, Yoshida A, Aoshi T, Miura T, Nagafusa T, Nagano A :Plasmid encoding interleukin-4 in the amelioration of murine collagen-induced arthritis. Arthritis Rheum. 50(3):968-975, 2004.

4. Uenoyama, S, Kobayashi T, Takenouchi Y, Yamashita K, Kazui T, Koide Y: Improvement of intestinal motility using S-methylisothiourea sulfate in a caine postoperative ileus model. Am J Surg 187 (1):93-937, 2004.

5.Nagata T, Aoshi T, Uchijima M, Suzuki M, Koide Y: Cytotoxic T-lymphocyte-, and helper T-lymphocyte-oriented DNA Vaccine. DNA and cell Biology, 23(2): 93-106, 2004.

6. Teramoto K, Kontani K, Ozaki Y, Sawai S, Tezuka N, Nagata T, Fujino S, Itoh Y, Taguchi O, Koide Y, Ohkubo I, Asai T, Ogasawara K: DNA Encoding a Pan-MHC Class II Peptide Analogue Augmented Antigen-specific Cellular Immunity and Suppressive Effects on Tumor Growth Elicited by DNA Vaccine Immunotherapy. Cancer Res 63: 7920-7925, 2003.

7.Nagatsu M, Terashita F, Koide Y: Low-temperature sterization with surface-wave-excited oxygen plasma. Jpn J Appl Phys. 42: L856-859, 2003.

8.Nakamura Y, Suda T, Nagata T, Aoshi T, Uchijima M, Yoshida A, Chida K, Koide Y, Nakamura H: Induction of protective immunity against an intracellular bacterium using dendritic cells retrovirally transduced with a minigene encoding a CTL epitope.  Infect Immun 71: 1748-1754, 2003.

9.Tozawa K, Hanai H, Sugimoto K, Baba S, Sugimura H, Aoshi T, Uchijima M, Nagata T, Koide Y: Evidence for the critical role of interleukin-12 but not interferon-g in the pathogenesis of experimental colitis in mice. J Gastroenterol Hepatol 18(5):578-587, 2003.

10.Uchiyama H, Nagata T, Yamada T, Uchijima M, Aoshi T, Suda T, Chida K, Nakamura H, Koide Y: Endosomal/lysosomal targeting of a single helper T-cell epitope of an intracellular bacterium by DNA immunization induces a specific T-cell subset and partial protective immunity in vivo. FEMS Microbiol. Lett. 216:91-97, 2002.

11.Nagata T, Aoshi T, Suzuki M, Uchijima M, Koide Y: Induction of antigen-specific T-cell subsets by DNA vaccination. Recent Research Development in Biophysics and Biochemistry 3: 89-106, 2003.

12.Li B, Koide Y, Uchijima M, Ohtawara Y,  Fujita K: Pretreatment of recipients with mitomycin-C-treated dendritic cells induces significant prolongation of cardiac allograft survival in mice. Transplant. Proc. 34: 3426-3428.

13.Sugimoto K, Hanai H, Tozawa K, Aoshi T, Uchijima M, Nagata T, Koide Y: Curcumin ameliorates trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) - induced colitis in mice. Gastroenterology 123:1912-1922, 2002.

14.Nagata T., Miki K., Kim Y-H., Uchijima M., Ohara N., Koide Y.: Induction of specific cellular immunity against Mycobacterium tuberculosis by recombinant attenuated self-destructing Listeria monocytogenes strains harboring eukaryotic expression plasmids for Ag85 family molecules. In: Thirty-seventh Research Conference on Tuberculosis and Leprosy, US-Japan Cooperative Medical Science Program, p.156-160, 2002.

15.Nagata T, Aoshi T, Suzuki M, Uchijima M, Kim YH, Yang Z, Koide Y: Induction of protective immunity to Listeria monocytogenes by immunization with plasmid DNA expressing a helper T-cell epitope that replaces the class II-associated invariant chain peptide of the invariant chain. Infect Immun. 70(5):2676-2680, 2002.

16.Nagata T., Higashi T., Aoshi T., Suzuki M., Uchijima M., Koide Y.: Immunization with plasmid DNA encoding MHC class II binding peptide/CLIP-replaced invariant chain (Ii) induces specific helper T cells in vivo: the assessment of Ii p31 and p41 isoforms as vehicles for immunization. Vaccine 20:105-114,2001.

17. Uchijima M., Raz E., Carson D.A., Nagata T., Koide Y.: Identification of immunostimulatory DNA-induced genes by suppression subtractive hybridization. Biochem. Biophys. Res. Commun. 286:688-691, 2001.

18.Yoshida A., Nagata T., Uchijima M., Koide Y.: Protective CTL response is induced in the absence of CD4+ T cells and IFN-γ by gene gun DNA vaccination with a minigene encoding a CTL epitope of Listeria monocytogenes. Vaccine 19(30):4297-4306, 2001.

19.Yamada T., Uchiyama H., Nagata T., Uchijima M., Suda T., Chida K., Nakamura H., Koide Y.: Protective CTL responses induced by DNA immunization against immunodominant and subdominant epitopes of Listeria monocytogenes are noncompetitive. Infect. Immun. 69(5): 3427-3430, 2001.

20.Yokota N., Uchijima M., Nishizawa S., Namba H., Koide, Y.: Identification of differentially expressed genes in rat hippocampus after transient global cerebral ischemia using subtractive cDNA cloning based on PCR.  Stroke 32: 168-174, 2001.

21.Yoshida A., Nagata T., Uchijima M., Higashi T., Koide Y.: Advantage of gene gun-mediated over intramuscular inoculation of plasmid DNA vaccine in reproducible induction of specific immune responses. Vaccine 18(17):1725-1729, 2000.

22.Koide Y., Nagata T., Yoshida A., Uchijima M.:DNA vaccines. Jpn. J. Pharmacol. 83:167-174, 2000.

23. Koide Y., Yoshida A., Nagata T., Yamada T., Uchijima M.: Induction of protective cytotoxic T lymphocytes by gene gun DNA immunization with minigenes encoding epitopes of Listeria monocytogenes. In: Thirty-fifth Research Conference on Tuberculosis and Leprosy, US-Japan Cooperative Medical Science Program, p.165-169, 2000.

24.Nakamura  S., Ohnishi K., Yoshida H., Shinjo K., Takeshita A., Tohyama K., Ohno R., Koide Y.: Retrovirus-mediated gene transfer of granulocyte-colony stimulating factor receptor (G-CSFR) cDNA into MDS cells and induction of their differentiation by G-CSF. Cytokines Cell. Mol. Ther. 6: 61-70, 2000.

25.Nagata T., Uchijima M., Yoshida A., Kawashima M., Koide Y.: Codon optimization effect on translational efficiency of DNA vaccine in mammalian cells: analysis of plasmid DNA encoding a CTL epitope derived from microorganisms. Biochem. Biophys. Res. Commun. 261:445-451, 1999.

26.Ide K., Hayakawa H., Yagi T., Sato A., Koide Y., Yoshida A., Uchijima M., Suda T, Chida K.,Nakamura H.: Decreased expression of Th2 type cytokine mRNA contributes to the lack of allergic bronchial inflammation in aged rats. J. Immunol. 163:396-402, 1999.

27.Yoshitomi A., Sato A., Hayakawa H., Chida K., Toyoshima M., Uchijima M., Yoshida A., Koide Y.: Biased T cell receptor Vbeta gene expression in bronchoalveolar lavage fluid from Japanese patients with sarcoidosis. Respirology  4:330-347, 1999.

28.Uchijima M., Yoshida, A., Nagata T., Koide Y.: Optimization of codon usage of plasmid DNA  vaccine is required for the effective MHC class I-restricted T cell responses against an intracellular bacterium. J. Immunol. , 161:5594-5599, 1998.

29.Koide Y., Nagata T., Yoshida A., Uchijima M.: DNA vaccines for infections with intracellular bacteria. Curr. Trends Immunol. 1:123-132, 1998.

30.Kageyama Y., Koide Y., Yoshida A., Uchijima M., Arai T., Miyamoto S., Ozeki T., Hiyoshi M.,Kushida K., Inoue T: Reduced susceptibility to collagen-induced arthritis in mice deficient in interferon-γ receptor. J.Immunol. 161(3):1542-1548, 1998.