免疫染色プロトコール
２００１年０６月現在
その1： 脱パラフィン
パラフィンを溶かし、組織を露出させる。
（１）５７℃の保温器に入っている免疫染色用スライドを取り出す。
（２）スライドをカゴに移し、（3）以下の手順で脱パラフィンを行う。
＊スライドはカゴに入れてくれてあることが多い。
＊カゴにはスライドが２０枚まで入る。
＊各槽に入れたら、最初カゴを上下に振り、スライドを液に馴染ませる。
（３）キシレン 1槽→ 2 槽→ 3槽（ 各３分おく ）
＊冬の寒い時はキシレンが溶けにくいので、キシレン１槽に5分おく。
（４）無水アルコール 1槽→ 2槽（ 各１分おく）
（５）９５％アルコール1槽→ 2槽→ ７０％アルコール槽→ ５０％アルコール槽
（ ひたす程度 ）
（６）水道水で洗浄（ アルコール成分を取り除くため ）
（７）カゴをイオン交換水に入れる
＊ここで中断可能：蒸留水に入れて冷蔵庫で保存。
その２： 必要に応じて抗原性を回復させるための前処理を行う。
必要ない場合はその３へ進む。
方法１：クエン酸緩衝液（ｐＨ６.０）によるＭ.Ｗ.処理 （通常の加熱処理）
（１）クエン酸緩衝液の２０倍濃縮液 ２５㎖ と 蒸留水 ４７５㎖ を圧力釜に入れる。
（２）カゴに入れたスライドを圧力釜に浸す。
＊カゴは２つまで圧力釜に入る。ただし、完全にカゴを浸すこと。
（３）圧力釜のふたを閉め、電子レンジで ５００Ｗ×１５分、加熱沸騰させる。
＊ここで中断可能：電子レンジにかけた後、そのまま一晩放置。
（４）圧力釜が冷えたら、ふたを開け、カゴを取り出し、ＰＢＳ溶液（リン酸緩衝液）で
３分×３回 洗浄する。
＊クエン酸緩衝液は繰り返し利用可能なので、５００㎖の三角フラスコに入れて
冷蔵庫で保存する。
方法２：1 ｍＭ EDTA緩衝液（ｐＨ８.０）による Ｍ.Ｗ.処理 （めったにやらない）
（１）０.５Ｍの EDTA 1㎖ と 蒸留水４９９㎖ を圧力釜に入れる。
＊後は方法1（２）以下と同じ。ただしEDTA溶液は一度使用したら捨てる。
＊方法１と２は、電子レンジでマイクロ波を照射し、加熱処理をする方法。
別の方法として、オートクレーブによる加熱処理もある。
方法３：ペプシン処理 （酵素によるタンパク消化）
（１）ペプシンを冷蔵庫から取り出し、室温に戻す。（吸湿を防ぐため）
（２）ドーゼを５７℃の保温器に入れて温めておく。
（３）ペプシンを溶かす蒸留水を三角フラスコに入れ、パラフィルムでふたをする。
バケツに水道のお湯を張り、そこに三角フラスコを入れて温めておく。
＊上記の（2）と（3）は、酵素反応を効率良く進めるために行う。
（４）０.４％ペプシン溶液の調製法
スライドの数 ７枚以下 ８枚以上
使用するド−ゼ 丸 四角
ペプシンの量 ０.２ｇ ０.６ｇ
蒸 留 水 ４９.９５㎖ １４９.８５㎖
０.１N ＨＣｌ ０.０５㎖ ０.１５㎖
（５）ペプシンを三角フラスコ中の温めた蒸留水に入れて溶かし、０.１ＮのＨＣｌを
加えて軽く振り混ぜる。
（６）調製したペプシン溶液を、温めておいたドーゼに移し、スライドをひたす。
（７）３７℃のふ卵器の中で２０分間、反応させる。
（８）ＰＢＳ溶液で ３分×３回 洗う。
＊ここで中断可能：洗浄後、ＰＢＳ溶液に入れて冷蔵庫で保存。
その３：内因性ペルオキシダーゼ除去
ヒトの体の中にある（内因性）ペルオキシダーゼ活性は、抗原抗体反応を検出する
酵素、ペルオキシダーゼと反応して抗原の同定を阻害する。そのため、一次抗体を
かける前に、内因性のペルオキシダーゼ活性を取り除いておく。
（１）メタノールに過酸化水素水を加えて、反応液を作る。
＊過酸化水素水が皮膚に触れると白く変色し痛くなるので、必ずゴム手袋を着用する。
（２）３％過酸化水素水／メタノール 混合溶液の調製法
スライドの数 ７枚以下 ８枚以上
使用するド−ゼ 丸 四角
メタノール ４５㎖ １３５㎖
３０％過酸化水素水 ５㎖ １５㎖
（３）混合溶液にスライドをひたし、室温で１０分（Ｍ.Ｗ.処理をしたスライドは１５分）
反応させる。切片の表面から泡が出てくるのが、反応の進んでいる証拠。
（４）ＰＢＳ溶液で ３分×３回 洗う。
＊ここで中断可能：洗浄後、ＰＢＳ溶液に入れて冷蔵庫で保存。
その４： 一次抗体反応
（１）ＰＢＳ溶液に入っているスライドをイオン交換水に移す。
（２）切片の周囲の水をよく拭き取ったあと、ダコペンで切片の周りを囲む。
＊滴下した抗体が周りに拡散しないように、枠を作る。
＊水分が残っていると、ダコペンの液が切片に染み込むので注意する。
（３）希釈が必要な濃縮抗体を、至適倍率まで薄める。
＊１.５㎖ のサンプルチューブの中で希釈する。
＊ BSA ( bovine serum albumin ) を加えたＰＢＳで抗体を薄める。
＊抗体を冷蔵庫から出したら、保冷剤を入れた発砲スチロール箱に移す。
＊希釈倍率に幅がある場合、特に指示がなければ、高い方の倍率を使う。
＊必要な抗体の量はスライド１枚あたり２００μｌ前後。
（この量は切片の大きさを見て決める）
（４）スライド上の余分な水分を拭き取り、準備した一次抗体を順次滴下する。
＊(3)で希釈した抗体は、ピペットを使って滴下する。この時、チップの先で
切片を傷付けないように注意すること。
＊希釈の必要がない抗体は、１枚のスライドに３滴ぐらい落とす。
（５）室温で３０分（Ｍ.Ｗ.処理をしたスライドは６０分）反応させる。
＊冷蔵庫に入れて一晩反応（Over Night）させる抗体もある。
（６）噴水びんに入れたＰＢＳ溶液で、スライド上の抗体を丁寧に洗い流す。
＊切片に直接噴射すると傷が付くかもしれないので注意して洗う。
（７）洗い流した順にド−ゼに戻し、さらにＰＢＳ溶液で ３分×３回 洗う。
＊ここで中断可能：洗浄後、ＰＢＳ溶液に入れて冷蔵庫で保存。
その５： シンプルステイン（ MULTI ）反応
アミノ酸ポリマーに、一次抗体を認識する部位と酵素（ペルオキシダーゼ）を結合
させた標識ポリマー。これを一次抗体と反応させると、抗原＝抗体＝ポリマー＝酵素
の複合体が形成される。この複合体の酵素活性を利用して、抗原を染色する。
（１）スライド上の余分な水分を拭き取り、シンプルステインを順次滴下する。
＊１枚のスライドに２〜３滴。
（２）室温で３０分反応させる。
（３）噴水びんに入れたＰＢＳ溶液で、スライド上の試薬を丁寧に洗い流す。
＊切片に直接噴射すると傷が付くかもしれないので注意して洗う。
（４）洗い流した順にド−ゼに戻し、さらにＰＢＳ溶液で ３分×３回 洗う。
（５）蒸留水で３回すすいだ後、冷蔵庫に入れて保存する。
免疫染色の仕事はここまで。発色は川端さんが見るので試薬の準備だけする。
その６：発色の準備
（１）準備する試薬 （手の空いた時にやっておく）
スライドの数 １４枚以下 １５枚以上
トリス緩衝液 ５０㎖ １５０㎖
D A B １０mg ３０mg
（２）トリス緩衝液は、冷蔵庫の中の大きなタンクに保存してある。タンクから必要量を
三角フラスコに移してパラフィルムでふたをし、また冷蔵庫に入れておく。
（３）DAB（遮光）も冷蔵庫内にあるので、室温に戻してから秤で計量する。
薬包紙で包んだあと、薬包紙の表面に粉末の量を記入し、冷蔵庫に入れておく。
トリス緩衝液を入れた三角フラスコの隣に置いておく。
＊DABは発ガン性があるので、必ずゴム手袋を着用して取り扱う。
参考：発色の方法
（１）トリス緩衝液を室温に戻してから、DABを加えて完全に溶かす。
（２）トリス緩衝液５０㎖に対して、３０％過酸化水素水 ５μｌを加え、これをドーゼに
移し、スライドを入れて発色させる。
（３）光学顕微鏡で発色の程度を観察しながら反応させる。
約３分〜５分で切片が茶褐色に染まってくる。
（４）発色が終わったら、スライドを蒸留水に入れて反応を止める。
免疫染色を行う上での注意事項
（１）切片を乾燥させない。乾燥は染色ムラの原因になる。
（２）切片には傷が付きやすいので、丁寧に扱う。
（３）ＰＢＳでの洗浄は確実に行う。（特に一次抗体のあと）
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免疫染色手順 |
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1、脱パラフィン |
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2、前処理 |
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前処理なし |
ペプシン処理 |
M.W.処理 |
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・ペプシンを室温に戻す ・ドーゼを55℃の保温器で温める ・D.W.を三角フラスコに入れて湯せんする ↓ 0.4% ペプシン溶液の調製
↓ 37℃で20分 ↓ PBS溶液で洗浄（3分３回） |
クエン酸緩衝液の調製 20倍濃縮液 25㎖ ＋ 蒸留水 475㎖ ↓ 電子レンジで加熱処理 500Wで15分 ↓ 冷ます ↓ PBS（3分３回） |
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3、内因性ペルオキシダーゼ除去 |
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反応液の調製 ：メタノール135㎖（45㎖）＋ 30％過酸化水素水15㎖（5㎖） |
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10分 ↓ PBS（３分３回） |
10分 ↓ PBS溶液で洗浄（3分3回） |
15分 ↓ PBS（3分3回） |
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4、イオン交換水に戻し、切片の周りをDAKOペンでマークして、一次抗体をのせる |
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30分 ↓ PBS（3分3回） |
30分 ↓ PBS溶液で洗浄（3分３回） |
60分 ↓ PBS（3分３回） |
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5、ヒストファイン シンプルステインPO（MULTI）をのせる |
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30分 ↓ PBS溶液で洗浄（3分３回） ↓ 蒸留水で３回洗浄したあと、冷蔵庫に保管 |
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6、発 色 ＊準備だけしておく |
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準 備： DAB 30r （10r）、トリス緩衝液 150㎖ （50㎖）を、各々量り取り、 別々に冷蔵庫に保管しておく。 発 色：トリス緩衝液を室温に戻してから、DABを加え完全に溶かす。 30％過酸化水素水をトリス50㎖に対し5μｌ加え、発色の具合を見ながら 反応させる。 発色後、蒸留水で洗う。 |
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